නිෂ්පාදන
2019-nCoV සඳහා Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR හඳුනාගැනීමේ කට්ටලය
අපේක්ෂිත භාවිතය
මෙම කට්ටලය නව කොරෝනා වයිරසය (2019-nCoV) උගුරේ තුවාල, නාසෝෆරින්ජියල් ස්පුබ්, බ්‍රොන්කොඇල්වෙයෝලර් ලාවේජ් තරලය, ස්පුටම් භාවිතයෙන් ගුණාත්මකව හඳුනා ගැනීම සඳහා භාවිතා කරයි. මෙම නිෂ්පාදනයේ හඳුනාගැනීමේ ප්රතිඵලය සායනික යොමුව සඳහා පමණක් වන අතර එය එකම එක ලෙස භාවිතා නොකළ යුතුය. සායනික රෝග විනිශ්චය සහ ප්රතිකාර සඳහා සාක්ෂි. රෝගියාගේ සායනික ප්‍රකාශන සහ අනෙකුත් රසායනාගාර පරීක්ෂණ සමඟ ඒකාබද්ධව තත්වය පිළිබඳ පුළුල් විශ්ලේෂණයක් නිර්දේශ කෙරේ.
පරීක්ෂා කිරීමේ මූලධර්මය
කට්ටලය එක්-පියවර RT- PCR තාක්ෂණය මත පදනම් වේ.ඇත්ත වශයෙන්ම, 2019 නව කොරෝනා වයිරස් (2019-nCoV) ORF1ab සහ N ජාන වර්ධක ඉලක්ක කලාප ලෙස තෝරා ගන්නා ලදී.විශේෂිත ප්‍රයිමර් සහ ප්‍රතිදීප්ත පරීක්ෂණ (N ජාන පරීක්ෂණ FAM සමඟ ලේබල් කර ඇති අතර ORF1ab පරීක්ෂණ HEX ලෙස ලේබල් කර ඇත) 2019 නව වර්ගයේ කොරෝනා වයිරස් RNA සාම්පලවල හඳුනා ගැනීමට නිර්මාණය කර ඇත.කට්ටලයට ආවේණික අභ්‍යන්තර පාලන හඳුනාගැනීමේ පද්ධතියක් (CY5 සමඟ ලේබල් කර ඇති අභ්‍යන්තර පාලන ජාන පරීක්ෂණය) ඇතුළත් වන අතර එමඟින් සාම්පල එකතු කිරීමේ ක්‍රියාවලිය, RNA සහ PCR විස්තාරණය කිරීම, එමඟින් ව්‍යාජ ඍණාත්මක ප්රතිඵල අඩු කරයි.
ප්රධාන සංරචක
| සංරචක | පරිමාව(48T/කට්ටල) |
| RT-PCR ප්රතික්රියා විසඳුම | 96µl |
| nCOV ප්‍රාථමික TaqMan probemixture (ORF1ab,N ජානය,RnaseP ජානය) | 864µl |
| සෘණ පාලනය | 1500µl |
| nCOV ධනාත්මක පාලනය (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
තමන්ගේම ප්රතික්රියාකාරක: RNA නිස්සාරණය හෝ පිරිසිදු කිරීමේ ප්රතික්රියාකාරක.සෘණ/ධන පාලනය: ධන පාලනය යනු ඉලක්ක ඛණ්ඩය අඩංගු RNA වන අතර සෘණ පාලනය න්‍යෂ්ටික අම්ල රහිත ජලය වේ.භාවිතය අතරතුර, ඔවුන් නිස්සාරණයට සහභාගී විය යුතු අතර ආසාදිත ලෙස සැලකිය යුතුය.අදාළ රෙගුලාසිවලට අනුකූලව ඒවා හැසිරවිය යුතු අතර බැහැර කළ යුතුය.
අභ්‍යන්තර විමර්ශන ජානය මානව RnaseP ජානයයි.
ගබඩා කොන්දේසි සහ කල් ඉකුත් වීමේ දිනය
-20±5℃, මාස 6ක් සඳහා වලංගු, 5 වතාවකට වඩා නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම වළක්වා ගන්න.
අදාළ උපකරණය
FAM / HEX / CY5 සහ අනෙකුත් බහු නාලිකා ප්‍රතිදීප්ත PCR උපකරණ සමඟ.
ආදර්ශ අවශ්යතා
1.අදාළ නිදර්ශක වර්ග: උගුරේ තුවාල, නාසෝෆරින්ජියල් ස්පුබ්, බ්‍රොන්කොඇල්වෙයෝලර් වොජ් තරලය, ස්පුටම්.
2.ආදර්ශ එකතුව (aseptic තාක්ෂණය)
ෆරින්ජියල් ස්පුබ්: ටොන්සිල සහ පසුපස ෆරින්ජියල් බිත්තිය එකවර ස්පුබ් දෙකකින් පිස දමන්න, ඉන්පසු ස්පුබ් හිස නියැදි ද්‍රාවණය අඩංගු පරීක්ෂණ නළයක ගිල්වන්න.
ස්පුටම්: රෝගියාට ගැඹුරු කැස්සක් ඇති වූ පසු, නියැදීම් ද්‍රාවණය අඩංගු ඉස්කුරුප්පු කැප් පරීක්ෂණ නළයක කැස්ස ඇති ස්පුටම් එකතු කරන්න;bronchoalveolar lavage fluid: වෛද්‍ය වෘත්තිකයන් විසින් නියැදීම.3.සාම්පල ගබඩා කිරීම සහ ප්රවාහනය
වෛරස් හුදකලා කිරීම සහ RNA පරීක්ෂණ සඳහා නිදර්ශක හැකි ඉක්මනින් පරීක්ෂා කළ යුතුය.පැය 24 ක් ඇතුළත හඳුනාගත හැකි නිදර්ශක 4℃ දී ගබඩා කළ හැක;24 තුළ හඳුනාගත නොහැකි ඒවා
පැය ගබඩා කළ යුත්තේ -70℃ හෝ ඊට පහළින් (-70℃ ගබඩා තත්වයක් නොමැති නම්, ඒවා විය යුතුය.
-20℃ශීතකරණයේ තාවකාලිකව ගබඩා කර ඇත).ප්‍රවාහනයේදී නිදර්ශක නැවත නැවත කැටි කිරීම සහ දියවීම වැළැක්විය යුතුය.නිදර්ශක එකතු කිරීමෙන් පසු හැකි ඉක්මනින් රසායනාගාරයට යැවිය යුතුය.සාම්පල දිගු දුරක් ප්රවාහනය කිරීමට අවශ්ය නම්, වියළි අයිස් ගබඩා කිරීම නිර්දේශ කරනු ලැබේ.
පරීක්ෂණ ක්රම
1 නියැදි සැකසීම සහ RNA නිස්සාරණය (නියැදි සැකසුම් කලාපය)
RNA නිස්සාරණය සඳහා දියර සාම්පල 200μl ගැනීම නිර්දේශ කෙරේ.අදාළ නිස්සාරණ පියවර සඳහා, වාණිජ RNA නිස්සාරණ කට්ටලවල උපදෙස් බලන්න.සෘණ සහ සෘණ යන දෙකම
මෙම කට්ටලයේ පාලනයන් නිස්සාරණයට සම්බන්ධ විය.
2 PCR ප්රතික්රියාකාරක සකස් කිරීම (ප්රතික්රියාකාරක සකස් කිරීමේ ප්රදේශය)
2.1 කට්ටලයෙන් සියලුම සංරචක ඉවත් කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී දියවීම සහ මිශ්ර කරන්න.භාවිතයට පෙර තත්පර කිහිපයක් සඳහා 8,000 rpm දී කේන්ද්රාපසාරී;අවශ්ය ප්රතික්රියාකාරක ප්‍රමාණය ගණනය කරන්න, සහ ප්රතික්රියා පද්ධතිය පහත වගුවේ පෙන්වා ඇති පරිදි සකස් කර ඇත:
| සංරචක | N සේවය (25µl පද්ධතිය) |
| nCOV ප්‍රයිමර් TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| RT-PCR ප්රතික්රියා විසඳුම | 2 µl × N |
| *N = පරීක්ෂා කළ සාම්පල ගණන + 1 (සෘණ පාලනය) + 1 (nCOVධනාත්මක පාලනය) | |
2.2 සංරචක හොඳින් මිශ්ර කිරීමෙන් පසු, නල බිත්තියේ ඇති සියලුම ද්‍රව නළයේ පතුලට වැටීමට කෙටි කාලයක් සඳහා කේන්ද්රාපසාරී කරන්න, ඉන්පසු 20 µl විස්තාරණ පද්ධතිය PCR නලයට එකතු කරන්න.
3 නියැදීම (නියැදි සකස් කිරීමේ ප්රදේශය)
නිස්සාරණයෙන් පසු සෘණ සහ ධන පාලනයන් 5μl එකතු කරන්න.පරීක්ෂා කළ යුතු නියැදියේ RNA PCR ප්රතික්රියා නලයට එක් කෙරේ.
විස්තාරණ හඳුනාගැනීමේ ප්‍රදේශයට මාරු කිරීමට පෙර නළය තදින් වසා තත්පර කිහිපයක් සඳහා 8,000 rpm දී කේන්ද්රාපසාරී කරන්න.
4 PCR විස්තාරණය (විස්තාරණය කළ හඳුනාගැනීමේ ප්රදේශය)
4.1 උපකරණයේ නියැදි සෛලය තුළ ප්රතික්රියා නළය තබා, පහත පරිදි පරාමිතීන් සකසන්න:
| අදියර | චක්රය අංකය | උෂ්ණත්වය(°C) | කාලය | එකතුඅඩවිය |
| ආපසු හැරවීමපිටපත් කිරීම | 1 | 42 | විනාඩි 10 | - |
| පූර්ව denaturation | 1 | 95 | මිනිත්තු 1 | - |
| චක්රය | 45 | 95 | තත්පර 15 යි | - |
| 60 | 30s | දත්ත එකතුව |
උපකරණ හඳුනාගැනීමේ නාලිකා තේරීම: ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව සඳහා FAM,HEX,CY5 නාලිකාව තෝරන්න.යොමු ප්‍රතිදීප්ත NONE සඳහා, කරුණාකර ROX තෝරා නොගන්න.
5 ප්රතිඵල විශ්ලේෂණය (කරුණාකර සැකසීම සඳහා එක් එක් උපකරණයේ පර්යේෂණාත්මක උපදෙස් බලන්න)
ප්රතික්රියාවෙන් පසුව, ප්රතිඵල සුරකින්න.විශ්ලේෂණයෙන් පසු, රූපයට අනුව මූලික අගයෙහි ආරම්භක අගය, අවසන් අගය සහ එළිපත්ත අගය සකසන්න (පරිශීලකයාට සත්‍ය තත්ත්වය අනුව සකස් කළ හැක, ආරම්භක අගය 3~15 ලෙසද, අවසාන අගය ලෙසද සැකසිය හැක. 5~20, ගැලපීම) ලඝුගණක ප්‍රස්ථාරයේ කවුළුවේ එළිපත්තෙහි, එළිපත්ත රේඛාව ලඝුගණක අවධියේ පවතින අතර සෘණ පාලනයේ විස්තාරණ වක්‍රය සරල රේඛාවක් හෝ එළිපත්ත රේඛාවට පහළින් වේ).
6 තත්ව පාලනය (පරීක්‍ෂාවට පරිපාටිමය පාලනයක් ඇතුළත් වේ) සෘණ පාලනය: FAM, HEX, CY5 හඳුනාගැනීමේ නාලිකා සඳහා පැහැදිලි විස්තාරණ වක්‍රයක් නොමැත
COV ධනාත්මක පාලනය: FAM සහ HEX හඳුනාගැනීමේ නාලිකාවල පැහැදිලි විස්තාරණ වක්‍රය, Ct අගය≤32, නමුත් CY5 නාලිකාවේ විස්තාරණ වක්‍රයක් නොමැත;
ඉහත අවශ්යතා එකම අත්හදා බැලීමේදී එකවර සපුරාලිය යුතුය;එසේ නොමැති නම්, අත්හදා බැලීම අවලංගු වන අතර එය නැවත නැවතත් කළ යුතුය.
7 ප්රතිඵල නිර්ණය කිරීම.
7.1 පරීක්ෂණ නියැදියේ FAM සහ HEX නාලිකාවල විස්තාරණ වක්‍රයක් හෝ Ct අගය> 40ක් නොමැති නම් සහ CY5 නාලිකාවේ විස්තාරණ වක්‍රයක් තිබේ නම්, 2019 නව කොරෝනා වයිරසයක් (2019-nCoV) නොමැති බව විනිශ්චය කළ හැකිය. සාම්පලයේ RNA;
.2 පරීක්ෂණ සාම්පලයේ FAM සහ HEX නාලිකාවල පැහැදිලි විස්තාරණ වක්‍ර තිබේ නම් සහ Ct අගය ≤40 නම්, නියැදිය 2019 නව කොරෝනා වයිරසයට (2019-nCoV) ධනාත්මක බව විනිශ්චය කළ හැක.
7.3 පරීක්ෂණ නියැදියට FAM හෝ HEX හි එක් නාලිකාවක පමණක් පැහැදිලි විස්තාරණ වක්‍රයක් තිබේ නම් සහ Ct අගය ≤40 නම් සහ අනෙක් නාලිකාවේ විස්තාරණ වක්‍රයක් නොමැති නම්, ප්රතිඵල නැවත පරීක්ෂා කිරීම අවශ්ය වේ.නැවත පරීක්ෂණ ප්රතිඵල අනුකූල නම්, නියැදිය නව සඳහා ධනාත්මක බව විනිශ්චය කළ හැක
කොරෝනා වයිරස් 2019 (2019-nCoV).නැවත පරීක්ෂා කිරීමේ ප්රතිඵලය සෘණාත්මක නම්, 2019 නව කොරෝනා වයිරසය (2019-nCoV) සඳහා නියැදිය සෘණාත්මක බව විනිශ්චය කළ හැක.
ධනාත්මක විනිශ්චය අගය
කට්ටලයේ යොමු CT අගය තීරණය කිරීම සඳහා ROC වක්‍ර ක්‍රමය භාවිතා කරන අතර අභ්‍යන්තර පාලන යොමු අගය 40 වේ.
පරීක්ෂණ ප්රතිඵල අර්ථ නිරූපණය
1.සෑම අත්හදා බැලීමක්ම සෘණ සහ ධනාත්මක පාලනයන් සඳහා පරීක්ෂා කළ යුතුය.පරීක්ෂණ ප්රතිඵල තීරණය කළ හැක්කේ පාලන තත්ත්ව පාලන අවශ්යතා සපුරාලන විට පමණි
2.FAM සහ HEX හඳුනාගැනීමේ නාලිකා ධනාත්මක වන විට, පද්ධති තරඟය හේතුවෙන් CY5 නාලිකාවේ (අභ්‍යන්තර පාලන නාලිකාව) ප්රතිඵලය සෘණ විය හැක.
3.අභ්‍යන්තර පාලන ප්රතිඵලය ඍණාත්මක වූ විට, tthe test tube හි FAM සහ HEX හඳුනාගැනීමේ නාලිකා ද සෘණ නම්, , එයින් අදහස් වන්නේ පද්ධතිය අක්‍රිය වී ඇති බව හෝ ක්‍රියාව වැරදියි, t පරීක්ෂණය වලංගු නොවන බවයි.එබැවින් සාම්පල නැවත පරීක්ෂා කිරීම අවශ්ය වේ.
